DNA复制始于基因组中的特定位置(复制起点),即启动蛋白的靶标位点。启动蛋白识别“富含AT”(富含腺嘌呤和胸腺嘧啶碱基)的序列,因为AT碱基对具有两个氢键(而不是CG对中形成的三个),因此更易于DNA双链的分离。一旦复制起点被识别,启动蛋白就会募集其他蛋白质一起形成前复制复合物,从而解开双链DNA,形成复制叉。复制叉的形成是多种蛋白质及酶参与的较复杂的过程。
多种DNA聚合酶在DNA复制过程中扮演不同的角色。在大肠杆菌中,DNA Pol III是主要负责DNA复制的聚合酶。它在复制分支上组装成复制复合体,具有极高的持续性,在整个复制周期中保持完整。相反,DNA Pol I是负责用DNA替换RNA引物的酶。 DNA Pol I除了具有聚合酶活性外,还具有5'至3'外切核酸酶活性,并利用其外切核酸酶活性降解RNA引物。 Pol I在DNA复制中的主要功能是创建许多短DNA片段,而不是产生非常长的片段。在真核生物中,Pol α有助于启动复制,因为它与引物酶形成复合物。
真核生物在染色体的多个点开始DNA复制,因此复制叉在染色体的许多点处相遇并终止。由于真核生物具有线性染色体,DNA复制无法到达染色体的最末端。由于这个问题,在染色体末端的DNA在每个复制周期中都会丢失。端粒是接近末端的重复DNA区域,有助于防止由于这种基因丢失。端粒缩短是体细胞中的正常过程,它缩短了子DNA染色体的端粒。因此,在DNA丢失阻止进一步分裂之前,细胞只能分裂一定次数。在生殖细胞中,端粒酶延伸端粒区域的重复序列以防止降解。